毛澤東到陝北以後，以檢討「白區工作」為突破點，採取聯合劉少奇，抑制周恩來的策略。
1937年受共產國際支持的王明回國，隨後中共出現兩個中央（延安中央，武漢的長江局），兩個聯盟（毛澤東與劉少奇的聯盟，周恩來與王明的聯盟）之間的對抗。但沒多久，王明就失去了共產國際的支持，敗給了毛澤東。周恩來也不得不公開向毛表示臣服。
1943年8月2日，周恩來在公開講話中對毛澤東表態交心，周說：「什麼是勝利的保證，勝利就握在毛澤東同志手中。」「二十二年黨的歷史證明，……毛澤東同志的方向，就是中國共產黨的方向。」
9月7日起，中央政治局會議中，毛澤東說：「六大選出的中央委員，其中只有毛澤東、劉少奇是左傾路線排擠打擊的，其餘多是擁護王明的。」接着，康生發言，一口氣數了王明六十多條罪狀，其中都是與六大後周恩來當家以來發生的事。這麼一來，會中情緒激動，罵的是王明，真正打的是周恩來。
毛澤東說：「六屆四中，王明上台，篡黨篡軍篡政，用的是流氓手段，六屆四中是不合法的。恩來同志要徹底檢查。」
毛澤東又說：「抗戰期間，王明和恩來領導的長江局。幻想與國民黨結成同盟，實際上是國民黨、大地主、買辦階級在中共黨內的應聲蟲和代理人。」
毛澤東又說：「長江局配合蔣介石保衛大武漢，新華日報成了國民黨的報紙，缺少階級立場和黨的獨立自主的原則，你們的黨性哪裏去了，長江局是反黨的。」
毛澤東又說：「你們打着馬列主義的旗幟，用教條八股嚇人，其實都是假馬克思主義者。我們按『聯共黨史簡明教程』，學習蘇聯共產黨的整黨經驗。」
周恩來當時在延安，每天要聽毛澤東、劉少奇、高崗等人對他的教育，就中共的歷史問題，要周重新認識，說周既犯了左傾又犯了右傾這樣那樣的錯誤。
1943年11月27日、28日，12月1、2、3日，周恩來一共作了五天的發言，痛斥自己的不是。周發言之前，毛澤東先作一段風趣的講話，毛說，這次整風，黨的整風是脫褲子，讓自己赤身露體暴露，然後在同志們的幫助下洗澡，洗清自己身體內外不潔的污物；最後是擦背，懲前毖後，治病救人，有病的人就感到舒暢了。毛澤東最後說了句：「現在，我們看恩來脫褲子吧。」大家笑了。周恩來突然在毛的面前跪下（周有演戲天才），連聲說：「我認罪，我認罪」。毛一驚，厲聲罵了一句：「你這不是罵我是封建皇帝嗎？」周說：「主席的確是中國革命的皇帝，我和少奇同志都一致同意的。」這是一場好戲的開場白。
周恩來後來說，經過這次延安整風，他「對毛澤東的領導確實心悅誠服地信服。」但是，毛澤東依然當面污辱周恩來，有一次，毛把周叫到身邊，周恭恭敬敬連叫了三次「主席」，毛才應了一個「嗯」字。
七大當選的中央委員中，周恩來的名次落在林彪、高崗、饒漱石、康生之後。在全部四十四名委員中，周恩來占第二十三名。毛澤東當選為中央委員會主席、中央政治局主席、中央書記處主席。中央書記處主管日常黨中央的領導工作，由毛澤東、劉少奇、任弼時三人為書記。劉少奇正式升為毛澤東以下的第二號人物。8月，中央政治局通過，在毛澤東離開時，由劉少奇代理主席職務。
中共建政後，周恩來仍多次挨毛澤東整。
1958年1月，南寧會議中，反冒進之聲泛濫，毛澤東、劉少奇認為，帶頭吹反冒進之風的是周恩來。3月成都會議，毛堅持要周寫檢討，劉少奇對鄧穎超說：「毛主席脾氣你和恩來都應該是熟悉的，毛主席對我說了重話『恩來不寫檢討就叫他滾蛋』，你就勸勸恩來吧。」鄧與周夫婦吵了一架，鄧說：「延安整風時，你自己說過，誰反對毛澤東同志，誰就是反黨，恩來你不檢討，這個關過不了，我們的前途都完了」，鄧穎超大哭大鬧，周恩來終於寫了檢討。11月，鄭州會議中，反冒進之聲仍然沒完沒了，毛劉認為，後台一定仍是周恩來。毛澤東把周恩來毒罵了一頓，然後又在會議上氣憤的指責說，「搞不好，黨要分裂，一分為二。」劉少奇指着周恩來說：「你要負分裂黨的責任。」
直到文革前夕，毛周又再度合作。
1966年4月，中央會議中，周恩來批判了彭真，「一系列的錯誤是同毛主席的思想對立。」彭真和薄一波都是劉少奇手下的主將。其後周恩來又下令逮捕薄一波、安子文等，並成立「六十一叛徒集團專案組」，組長為周恩來。
造反派審判王光美，把王光美打成美國特務，並成立了「王光美項目組」，組長也是周恩來。
周恩來當時說：「這次文化大革命非常及時，否則，讓劉少奇這個叛徒、內奸、工賊、野心家上台，中國肯定復辟資本主義，千萬人頭落地。」因此，毛澤東批示：「劉少奇專案組，由總理（周恩來）親自抓。」
1968年10月中共八屆12次全會中，通過了以周恩來為組織的「關於叛徒、內奸、工賊劉少奇罪行的審查的報告，並將劉少奇永遠開除黨籍，撤消其黨內外一切職務。」
儘管文革中周對毛一再下拜表示效忠，協助毛打倒了劉少奇，但毛始終不信他，江青說過周恩來「貌似忠貞實屬大奸」，這句話實際上是毛澤東的。後來四人幫時代，周又被毛以「伍豪（周恩來）脫黨啟示」糾纏不已，1975年，周兩次電毛說，「我不是叛徒。」並在有關的資料上，用發抖的手簽了字，周臨死以前，口中念念有詞：「我不是叛徒。」
終其一生，毛周既彼此敵對又互相依存，既不能相忍又不能不忍，既不能兼容又不能不兼容，既是「親密的戰友」，又是不共戴天的死敵，親密時如膠似漆，鬥爭時你死我活，可以說纏鬥了一輩子，又合作了一輩子。
